PCR, adalah reaksi berantai polimerase, yang mengacu pada penambahan dNTP, Mg2+, faktor pemanjangan dan faktor peningkatan amplifikasi ke sistem di bawah katalisis DNA polimerase, menggunakan DNA induk sebagai templat dan primer spesifik sebagai titik awal ekstensi. Melalui langkah-langkah denaturasi, anil, ekstensi, dll., proses replikasi in vitro DNA untai anak yang melengkapi DNA cetakan untai induk dapat dengan cepat dan spesifik memperkuat DNA target apa pun secara in vitro.
1. PCR Mulai Panas
Waktu mulai amplifikasi pada PCR konvensional bukanlah dengan memasukkan mesin PCR ke dalam mesin PCR, kemudian program mulai melakukan amplifikasi.Ketika konfigurasi sistem selesai, amplifikasi dimulai, yang dapat menyebabkan amplifikasi non-spesifik, dan PCR hot-start dapat mengatasi masalah ini.
Apa itu PCR mulai panas?Setelah sistem reaksi disiapkan, pengubah enzim dilepaskan pada suhu tinggi (biasanya lebih tinggi dari 90°C) selama tahap pemanasan awal reaksi atau tahap “start panas”, sehingga DNA polimerase diaktifkan.Waktu dan suhu aktivasi yang tepat bergantung pada sifat DNA polimerase dan pengubah hot-start.Metode ini terutama menggunakan pengubah seperti antibodi, ligan afinitas, atau pengubah kimia untuk menghambat aktivitas DNA polimerase.Karena aktivitas DNA polimerase dihambat pada suhu kamar, teknologi hot start memberikan kemudahan yang besar untuk menyiapkan beberapa sistem reaksi PCR pada suhu kamar tanpa mengorbankan spesifisitas reaksi PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transkripsi PCR) adalah teknik eksperimental untuk membalikkan transkripsi dari mRNA menjadi cDNA dan menggunakannya sebagai templat untuk amplifikasi.Prosedur percobaannya adalah mengekstraksi RNA total dalam jaringan atau sel terlebih dahulu, menggunakan Oligo (dT) sebagai primer, menggunakan transkriptase balik untuk mensintesis cDNA, kemudian menggunakan cDNA sebagai template amplifikasi PCR untuk mendapatkan gen target atau mendeteksi ekspresi gen.
3. PCR kuantitatif neon
PCR kuantitatif fluoresen (PCR Kuantitatif Waktu Nyata,RT-qPCR) mengacu pada metode penambahan gugus fluoresen ke sistem reaksi PCR, menggunakan akumulasi sinyal fluoresen untuk memantau seluruh proses PCR secara real-time, dan terakhir menggunakan kurva standar untuk menganalisis templat secara kuantitatif.Metode qPCR yang umum digunakan termasuk SYBR Green I dan TaqMan.
4. PCR Bersarang
PCR Bersarang mengacu pada penggunaan dua set primer PCR untuk dua putaran amplifikasi PCR, dan produk amplifikasi putaran kedua adalah fragmen gen target.
Jika ketidakcocokan pasangan primer pertama (primer luar) menyebabkan produk non-spesifik teramplifikasi, kemungkinan daerah non-spesifik yang sama dikenali oleh pasangan primer kedua dan terus teramplifikasi sangatlah kecil, sehingga amplifikasi oleh pasangan primer kedua, spesifisitas PCR telah ditingkatkan.Salah satu keuntungan melakukan dua putaran PCR adalah membantu memperkuat produk yang cukup dari DNA awal yang terbatas.
5. PCR pendaratan
Touchdown PCR merupakan metode untuk meningkatkan spesifisitas reaksi PCR dengan mengatur parameter siklus PCR.
Dalam touchdown PCR, suhu anil untuk beberapa siklus pertama diatur beberapa derajat di atas suhu anil maksimum (Tm) primer.Temperatur anil yang lebih tinggi dapat secara efektif mengurangi amplifikasi non-spesifik, namun pada saat yang sama, suhu anil yang lebih tinggi akan memperburuk pemisahan primer dan sekuens target, yang mengakibatkan berkurangnya hasil PCR.Oleh karena itu, dalam beberapa siklus pertama, suhu anil biasanya diatur turun sebesar 1°C per siklus untuk meningkatkan kandungan gen target dalam sistem.Ketika suhu anil diturunkan ke suhu optimal, suhu anil dipertahankan untuk sisa siklus.
6. PCR langsung
PCR langsung mengacu pada amplifikasi DNA target langsung dari sampel tanpa memerlukan isolasi dan pemurnian asam nukleat.
Ada dua jenis PCR langsung:
metode langsung: ambil sedikit sampel dan tambahkan langsung ke PCR Master Mix untuk identifikasi PCR;
metode perengkahan: setelah pengambilan sampel sampel, tambahkan ke lisat, lisis untuk melepaskan genom, ambil sedikit supernatan yang telah dilisiskan dan tambahkan ke PCR Master Mix, lakukan identifikasi PCR.Pendekatan ini menyederhanakan alur kerja eksperimental, mengurangi waktu praktik, dan menghindari kehilangan DNA selama langkah pemurnian.
7. PCR BUMN
Penyambungan gen dengan ekstensi tumpang tindih PCR (SOE PCR) menggunakan primer dengan ujung yang saling melengkapi untuk membuat produk PCR membentuk rantai yang tumpang tindih, sehingga pada reaksi amplifikasi berikutnya, melalui perpanjangan rantai yang tumpang tindih, sumber teknik A yang berbeda di mana fragmen yang diamplifikasi tumpang tindih. dan disambung menjadi satu.Teknologi ini saat ini memiliki dua arah penerapan utama: konstruksi gen fusi;mutasi yang diarahkan pada lokasi gen.
8. IPCR
Inverse PCR (IPCR) menggunakan primer komplementer terbalik untuk memperkuat fragmen DNA selain kedua primer tersebut, dan memperkuat urutan yang tidak diketahui pada kedua sisi fragmen DNA yang diketahui.
IPCR pada awalnya dirancang untuk menentukan urutan wilayah yang tidak diketahui dan berdekatan, dan sebagian besar digunakan untuk mempelajari urutan promotor gen;penataan ulang kromosom onkogenik, seperti fusi gen, translokasi dan transposisi;dan integrasi gen virus, juga umum digunakan saat ini. Untuk mutagenesis terarah lokasi, salin plasmid dengan mutasi yang diinginkan.
9. dPCR
PCR Digital (dPCR) adalah teknik kuantifikasi absolut molekul asam nukleat.
Saat ini ada tiga metode untuk kuantifikasi molekul asam nukleat.Fotometri didasarkan pada penyerapan molekul asam nukleat;PCR kuantitatif fluoresen waktu nyata (PCR Waktu Nyata) didasarkan pada nilai Ct, dan nilai Ct mengacu pada nomor siklus yang sesuai dengan nilai fluoresensi yang dapat dideteksi;PCR digital adalah teknologi Kuantitatif terbaru berdasarkan metode PCR molekul tunggal untuk menghitung kuantifikasi asam nukleat adalah metode kuantitatif absolut.
Waktu posting: 13 Juni 2023