Penggunaan dan tindakan pencegahan tabung centrifuge ultrafiltrasi
1) Pilih tabung ultrafiltrasi yang sesuai.Perhatikan bahwa membran UF berbeda dalam tingkat toleransinya terhadap berbagai bahan kimia.Biasanya, tabung ultrafiltrasi dengan batas berat molekul 10 kDa dapat dipilih dengan batas berat molekul yang tidak boleh lebih besar dari 1/3 berat molekul protein yang diinginkan, misalnya 35 kDa.Jika berat molekul protein yang diinginkan adalah sekitar 10 kD, tabung ultrafiltrasi dengan batas berat molekul 3 KD dapat digunakan.
(2) Ultrafiltrasi, yang baru dibeli, dikeringkan, dengan air ultra murni ditambahkan sebelum digunakan dan air dilewatkan seluruhnya melalui membran, penangas es atau lemari es yang telah didinginkan sebelumnya selama beberapa menit.Airnya kemudian dituang, yaitu cairan proteinnya, dan ditambahkan berapa banyak, yang mana yang tidak lebih dari garis putih di bagian atas tabung.Pengoperasiannya ringan, dan tabung ultrafiltrasi perlu didinginkan terlebih dahulu di atas es sebelum menambahkan larutan protein.
3) Massa dan pusat gravitasi harus mencapai keseimbangan.Perhatikan kecepatan putaran dan akselerasinya tidak terlalu cepat, jika tidak maka akan langsung merusak membran ultrafiltrasi.Ultrafiltrasi sentrifugal dimulai (sentrifugasi didinginkan terlebih dahulu hingga 4 derajat).Setelah RPM sentrifugal yang berbeda diubah menjadi g, hasilnya berbeda.Percepatan centrifuge diatur seminimal mungkin, sehingga mengurangi tekanan pada membran.Catatan, pastikan untuk meninggalkan centrifuge setelah centrifuge mencapai kecepatan tujuannya, atau jika Anda mengalami masalah, Anda tidak dapat mengatasinya untuk pertama kali.Orientasi membran ke spindel disesuaikan sesuai dengan instruksi (kotak centrifuge sudut adalah membran ke sumbu tegak lurus).Dalam penggunaan praktis, kecepatan putaran umum lebih rendah dari yang ditentukan dalam petunjuk, sehingga umur tabung centrifuge dapat diperpanjang.
3) Massa dan pusat gravitasi harus mencapai keseimbangan.Perhatikan kecepatan putaran dan akselerasinya tidak terlalu cepat, jika tidak maka akan langsung merusak membran ultrafiltrasi.Ultrafiltrasi sentrifugal dimulai (sentrifugasi didinginkan terlebih dahulu hingga 4 derajat).Setelah RPM sentrifugal yang berbeda diubah menjadi g, hasilnya berbeda.Percepatan centrifuge diatur seminimal mungkin, sehingga mengurangi tekanan pada membran.Catatan, pastikan untuk meninggalkan centrifuge setelah centrifuge mencapai kecepatan tujuannya, atau jika Anda mengalami masalah, Anda tidak dapat mengatasinya untuk pertama kali.Orientasi membran ke spindel disesuaikan sesuai dengan instruksi (kotak centrifuge sudut adalah membran ke sumbu tegak lurus).Dalam penggunaan praktis, kecepatan putaran umum lebih rendah dari yang ditentukan dalam petunjuk, sehingga umur tabung centrifuge dapat diperpanjang.
(4) Ketika dipekatkan hingga tersisa 1ml, ambil 50ul larutan buffer, tambahkan 10ul aliran dan lihat apakah ada warna biru, sebagai penilaian apakah tabung ultrafiltrasi kehilangan protein.Jika tabung bocor, tuangkan kembali lapisan atas dan alirkan ke dalam tabung baru untuk memulai ultrafiltrasi.Untuk menentukan dengan tepat apakah ada tabung yang terlewat, sentrifugasi selama 10 menit dengan 5mgml BSA sebelum dialirkan, gunakan lem protein, atau uji kasar Bradford, dan lanjutkan dengan menambahkan sisa larutan protein pekat (yang bekerja pada es dan mencegah protein memanas) hingga semua konsentrat telah ditambahkan.Berhati-hatilah selama sentrifugasi jika terjadi pengendapan protein yang menyebabkan penutupan tabung.Jika terjadi presipitasi, tentukan apakah penyebab spesifik presipitasi adalah konsentrasi protein yang berlebihan atau buffer yang tidak tepat;Yang pertama dapat diselesaikan dengan ultrafiltrasi beberapa tabung ultrafiltrasi secara bersamaan, menurunkan konsentrasi, dan yang terakhir dengan menukar larutan buffer yang berbeda sampai tidak terjadi pengendapan protein.
(4) Ketika dipekatkan hingga tersisa 1ml, ambil 50ul larutan buffer, tambahkan 10ul aliran dan lihat apakah ada warna biru, sebagai penilaian apakah tabung ultrafiltrasi kehilangan protein.Jika tabung bocor, tuangkan kembali lapisan atas dan alirkan ke dalam tabung baru untuk memulai ultrafiltrasi.Untuk menentukan dengan tepat apakah ada tabung yang terlewat, sentrifugasi selama 10 menit dengan 5mgml BSA sebelum dialirkan, gunakan lem protein, atau pengujian kasar Bradford, dan lanjutkan dengan menambahkan sisa larutan protein pekat (yang bekerja pada es dan mencegah protein memanas) hingga semua konsentrat telah ditambahkan.Berhati-hatilah selama sentrifugasi jika terjadi pengendapan protein yang menyebabkan penutupan tabung.Jika terjadi presipitasi, tentukan apakah penyebab spesifik presipitasi adalah konsentrasi protein yang berlebihan atau buffer yang tidak tepat;Yang pertama dapat diselesaikan dengan ultrafiltrasi beberapa tabung ultrafiltrasi secara bersamaan, menurunkan konsentrasi, dan yang terakhir dengan menukar larutan buffer yang berbeda sampai tidak terjadi pengendapan protein.
(5) Beberapa langkah pertama digunakan untuk memekatkan protein, dan jika buffer ingin diubah, tambahkan buffer baru secara perlahan (ultrafiltrasi melalui membran ultrafiltrasi 0,22um) menjadi sekitar 1ml dari total protein, dan konsentrasikan kembali menjadi sekitar 1ml selama tiga kali berturut-turut, dengan volume akhir pekat akhir tergantung pada konsentrasi protein yang diinginkan, umumnya tidak lebih dari 500ul, tetapi juga dalam 200ul.Mencapai 1000 × atau lebih pada tiga kesempatan, pada dasarnya sama dengan perubahan buffer, yang dihitung dengan setidaknya 10 × atau lebih pengayaan volume setiap kali.
(5) Beberapa langkah pertama digunakan untuk memekatkan protein, dan jika buffer ingin diubah, tambahkan buffer baru secara perlahan (ultrafiltrasi melalui membran ultrafiltrasi 0,22um) menjadi sekitar 1ml dari total protein, dan konsentrasikan kembali menjadi sekitar 1ml selama tiga kali berturut-turut, dengan volume akhir pekat akhir tergantung pada konsentrasi protein yang diinginkan, umumnya tidak lebih dari 500ul, tetapi juga dalam 200ul.Mencapai 1000 × atau lebih pada tiga kesempatan, pada dasarnya sama dengan perubahan buffer, yang dihitung dengan setidaknya 10 × atau lebih pengayaan volume setiap kali.
Waktu posting: 09-November-2022